真核生物目的基因的獲取
基因工程流程的第一步就是獲得目的基因，如何獲得目的基因就成為基因工程的關鍵問題。所謂目的基因就是已被或者將要被分離、改造、擴增或表達的特定基因或DNA段。目的基因的來源，不外乎是分離自然存在的基因或人工合成基因。常用的方法有：物理化學法、化學合成(人工合成)法、逆轉錄(cDNA文庫)法、基因文庫法、PCR法。
一、物理化學法
DNA雙鏈結構的特點和四種鹼基互補的氫鍵差異，是理化方法分離基因的依據，其方法有以下三種：密度梯度離心法,單鏈酶法,多聚賴氨酸法。
1、密度梯度離心法
研究發現，rDNA和tDNA基因不但存在許多重複單位，而且含有較多的G和C，所以比一般的'DNA密度大，而且較重，利用CsCl密度梯度離心法進行離心就可使這類DNA在離心管內較低位置形成區帶，收集後就可獲得這類基因。
2.單鏈酶法
由於DNA分子中G-C對比A-T對穩定，加熱變性時，A-T多的部位先變性，雙鏈解開，再用S1核酸酶切去單鏈部分，經超速離心處理，就可得到GC含量高的基因。用這種方法已分離出GC含量高達63%的海膽rDNA。
3.多聚賴氨酸法
人工合成的賴氨酸多聚體能與AT含量高的DNA結合，發生沉澱。利用這一特性，可將DNA混合物中AT含量高的DNA沉澱後除去，再進行分離純化就可得到GC含量高的rDNA和tDNA。
二、化學(人工)合成法
如果已知某種基因的核苷酸序列，或根據某種基因產物的氨基酸序列推匯出為該多肽鏈編碼的核苷酸序列，就可以利用DNA合成儀通過化學合成法合成目的基因。一般用於小分子活性多肽基因和引物的合成，對於分子量較大的目的基因，可通過分段合成，然後通過連線酶連線組裝成完整的基因。目前，利用該法合成的基因已有人生長激素釋放抑制因子、胰島素原、腦啡汰及干擾素基因等。
三、逆轉錄(cDNA文庫)法
該法主要用於合成分子量較大而又不知其序列的基因。它是一種酶促合成法，即以mRNA為模板，在逆轉錄酶作用下合成cDNA第一鏈，再在DNA聚合酶作用下合成雙鏈cDNA，與適當載體結合後轉入受體菌，擴增後即為cDNA文庫。然後，採用適當的方法從cDNA文庫中篩選出目的基因。目前，cDNA文庫的型別：普通cDNA文庫、全長cDNA文庫、均一化cDNA文庫、全長均一化cDNA文庫。
四、基因文庫法
基因文庫的構建是一種直接從基因組中分離目的基因的方法。首先，用限制性內切酶將某一種生物細胞的整個基因組DNA切割成大小合適的片段，然後將這些片段與載體連線，再轉化到細菌中去，讓宿主菌長成克隆。這樣，一個克隆內的每個細胞的載體上都含有特定的基因組片段。存在於轉化菌內、由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合就稱為基因組文庫(genomiclibrary)或基因文庫(genelibrary)。從理論上講，這些重組子應包含整個基因組DNA序列，即包含了某種生物細胞的全部基因。基因文庫的構建一般包括五個基本步驟：①細胞染色體大分子DNA的提取和大片段的製備；②載體D(轉載於:plificationofcDNAEnd,RACE)技術。
五、基於PCR的基因克隆
PCR一般步驟： ①變性(denaturation)，即將模板DNA置於94-95℃的高溫下，使雙鏈解開變成單鏈DNA；②退火(annealing)，將反應體系的溫度降到45-65℃左右，使一對引物能分別與變性後的兩條模板鏈互補配對 ；③延伸(prolong)，將反應體系溫度調整到72℃(以Taq DNA聚合酶為例)，合成新的DNA鏈。若干迴圈後，目的DNA分子就會得到迅速擴增。PCR引物類別：特異引物、同源引物、簡併引物、隨機引物。
1. 普通特定PCR
知道目的基因的全序列或兩端的序列，可根據其兩端序列設計特定的引物進行PCR擴增。
2. 反向PCR
反向PCR (Inverse PCR, I-PCR)是一種根據已知序列擴增其旁側序列的方法，適用於已知序列旁側啟動子等調控序列的擴增。已知序列可以是cDNA或EST(表達序列標籤)序列，設計引物時應在外顯子區(不應落在外顯子拼接點上或內含子區)，且經常會在引物5’端加上一個酶切位點和幾個包含鹼基，如GCTAGAATTCAGCTGATCTGAGCTTATC(紅色標註的為EcoR I酶切位點)。
3. 錨定PCR
錨定PCR (Anchored PCR)是一種根據已知序列擴增其旁側序列的方法，適用於已知序列旁側啟動子等調控序列的擴增。由此發展了cDNA末端快速擴增(Rapid Amplification of cDNA End, RACE)技術。
4. 差異表達基因的獲取
根據兩種組織或不同生理、病理、環境條件下同種組織之間的差異，可以利用許多方法篩選出差異表達的基因。常用的有： 差異顯示反轉錄PCR (Differential Display Reverse Transcription, DDRT-PCR)、代表性差式分析(Representational Difference Analysis, RDA)、抑制性消減雜交(Suppression Subtractive Hybridization, SSH)等。
