基因分子生物學-研究生必修

一．controlofprokaryoticgeneexpression

Ⅰ名詞解釋名詞解釋

on操縱子，是基因表達調控的基本單位，包含結構基因、操縱基因等一些相鄰基因組成的DNA段，其中操縱基因可被調節蛋白識別並調控，結構基因的表達又受到操縱基因的調控。

cibleoperon可誘導操縱子，當環境出現某一小分子時，與代謝相關的基因表達，即誘導物所誘導的操縱子為可誘導操縱子，如lac操縱子，在誘導物作用下可產生本身代謝所需要的酶。

ator操縱基因，是操縱子結構基因前的DNA區段，可以結合阻遏物或活化物。常位於基因啟動子的後面或與啟動子重疊，可控制臨近結構基因的表達。

-repressor輔阻遏物，阻遏蛋白與某一個小分子結合後活性被啟用，阻止產生合成這種小分子相關的酶，那麼這種小分子稱為~~，例如色氨酸。

essibleoperon可阻遏操縱子，共阻遏物所抑制的操縱子為可阻遏操縱子，即共阻遏物的存在可以抑制結構基因所編碼酶的表達，如trp操縱子等氨基酸合成相關的操縱子。

nuator衰減子，是Trp操縱子一段特殊的調控序列。位於上游啟動子與第一個結構基因之間，是Trp操縱子含有的一個特殊調節序列，色氨酸操縱子的前導序列有4個關鍵區，當大腸桿菌細胞中色氨酸水平較高，核糖體迅速的翻譯前導序列中的序列1，生成14肽，並在轉錄序列3之前佔據序列2轉錄產物，以致前導序列轉錄產物序列3和序列4互補，形成類似終止子的衰減子結構。

mones訊號素，原核生物應急反應中所產生的訊號分子，ppGpporpppGpp(鳥苷4/5磷酸),它們通過與靶蛋白的結合來改變其活性即刻產生調控作用，從而對代謝做出調節。

hage原噬菌體，某些溫和噬菌體侵染細菌後，其DNA整合到宿主染色體上，處於整合狀態的噬菌體DNA為原噬菌體。它是繁殖和傳遞噬菌體本身遺傳資訊的一種重要方式。

switch核糖開關，是原核生物中一類調節RNA元件，它可以直接感受小分子的代謝來控制轉錄和翻譯，是不依賴調控蛋白的一種調節方式。

s細菌內小RNA，sRNAs是細菌內長80~100nt的RNA調控序列。它們一般不由大的RNA前體形成，而是被自身基因所編碼產生。大多數的sRNA通過與靶mRNA配對來抑制轉錄，有些情況也促進轉錄。

senseRNAs反義RNA，由+DNA鏈轉錄產生。一個RNA可以與某一個基因轉錄出的mRNA互補，那麼這個RNA則稱為此mRNA的反義RNA，抑制mRNA的翻譯，主要在翻譯水平上調節基因表達的一種RNA（少數可調節其轉錄）。

Ⅱ簡答簡答

1.簡述lacoperon的調控機制。的調控機制Lac操縱子由操縱基因O、結構基因Z、Y、A及調節基因組成。lac操縱子在啟動子的-35區缺乏UP元件，為弱啟動子。CAP和Repressor分別通過影響RNAP與啟動子的結合來對lac基因進行調控。是通過CAP蛋白的正調節和Repressor的負調節這兩種調節來實現的

1)當葡萄糖和乳糖都存在時，由於葡萄糖的存在，細胞中的cAMP的水平則會降低，而cAMP對CAP的活性是必1須的，所以此時CAP無活性，不能和CAPsite結合；而由於乳糖的存在，它可以與Repressor結合使其構象改變，從而不能結合在operator上，此時RNAP結合在啟動子上，由於lacgene的啟動子是弱啟動子，在沒有CAP蛋白結合時，RNAP與之的結合比較弱，處於基礎水平轉錄；

2)當只有葡萄糖存在時，此時CAP蛋白依然沒有活性，不能和CAPsite結合；由於沒有

乳糖存在，此時阻遏蛋白結合到操縱基因上，啟動子和操縱基因有重疊區，Repressor的結合阻止了RNAP與啟動子的結合，阻止了轉錄的發生；

3)當只有乳糖存在時，cAMP濃度升高，此時CAP與cAMP結合，表現出較高的活性，結合於CAPsite；此時乳糖與repressor結合，使其構象改變，不能結合在operator上，RNAP則可與啟動子結合；而CAP蛋白具有募集作用，可以幫助RNAP結合到啟動子上，從而使得轉錄水平大大升高；

4)當兩種糖都不存在時，CAP可以結合到CAPsite上；同時repressor也結合到operator上，阻止RNAP的結合，阻止基因的轉錄。

2.如何利用實驗證明CAP蛋白的作用機制。

蛋白的作用機制。CAP蛋白的作用機制是募集RNAP到啟動子上，可以用啟用蛋白旁路實驗來證明。

1）用蛋白與蛋白的相互作用取代CAP跟RNAP的相互作用：蛋白與DNA結合域偶聯，蛋白取代RNAP的α-CTD，YX只要啟動子附近有合適的結合位點，被稀釋過的聚合酶就能被拼湊起來的“啟用蛋白”啟用，結合於啟動子起始轉錄。

2）α-CTD被CAP的DNA結合域取代，在無任何啟用蛋白時，只要附近有合適的DNA結合位點，這一修飾過的聚合酶就能有效的起始從lac開始的轉錄。

3）無任何啟用蛋白，但RNAP是高濃度的，基因以啟用水平表達。這三個實驗說明CAP蛋白只是通過與α-CTD作用，募集RNAP到啟動子上起始轉錄。

3.為什麼常利用lacZ作為reportors？？

在乳糖類似物IPTG的誘導下，LacZ編碼β-半乳糖苷酶，該酶和底物反應很敏感，可水解二糖的糖苷鍵使其生成單糖，該反應利用一個生色底物（如X-gal，無色）和?-半乳糖苷酶進行反應，反應後生成藍色的沉澱，很容易檢測。通過測定藍色產物的產生，不僅可以定性還可以定量測定出?-半乳糖苷酶的活性水平，故常作為報告基因。LacZ具有操作簡單、準確度高、解析度高、直接反映蛋白表達水平等優點，因此適合做報告基因。

epressor如何結合於operators？？

Lac阻遏蛋白有DNA結合域，核心域，寡聚化結構域。以四聚體形式與operator結合。其DNA結合結構域為HTH模體，其中一個α螺旋適合插入DNA的大溝，與其中的特異鹼基結合。另一個α螺旋橫跨DNA大溝與DNA主鏈相聯絡，以保證第一個螺旋出現在正確的位置，同時也增加蛋白質-DNA相互作用的結合能。C端通過oligomerization（寡聚化）：Monomer—dimer—tetramer，這就形成兩個DNA-bindingsite，可以同時結合兩個operator。其中一個必結合一個離啟動子最近的一個親和力最高的operator(O1)，而另一個dimer結合另一個operator(O2orO3)，之間的DNA形成loop式結構，從而發揮作用。

5.舉例說明原核activators的主要作用機制。舉例說明原核的主要作用機制。

原核啟用蛋白作用的主要機制有二：1）通過募集RNA聚合酶啟用轉錄，如lac操縱子的啟用蛋白；2）通過變構作2用啟用RNAP：ⅰ改變RNAP的構象使啟動子活化，glnA啟動子的NtrC啟用蛋白；如ⅱ誘導啟動子DNA構象改變，如merT啟動子的`MerR啟用蛋白。1）CAP:募集作用，與RNAP協同來起始轉錄；2）NtrC：RNAP作用，與利用NtrC的ATPase的活性，水解ATP所釋放的能量來改變RNAP的構象，使得它從close狀態變為open；3）MerR：改變啟動子區的DNA的構象，縮短DNA-35區和-10區之間的距離，並且使DNA發生旋轉，從而使-35區和-10區朝同一側。

6.舉例說明原核repressors的主要作用機制。的主要作用機制。

原核阻遏蛋白的作用機制有二：1）抑制RNAP跟啟動子的結合，由於阻遏蛋白結合位點與RNAP的結合位點有重疊區，因此RNAP被排斥，如laz操縱子中的Lac阻遏蛋白；2）阻遏蛋白結合到非啟動子位點，與RNAP相互作用，從而抑制轉錄起始，如的Gal阻遏蛋白。

8.簡述trpoperon的調控機制。的調控機制Trp操縱子（typoperon）負責Trp的生物合成，包括啟動子，操縱基因及5個結構基因。在第一個結構基因的上游有一段簽到序列，其轉錄產物可以分為4個區域，通過配對調控基因表達。當培養基中有足夠的Trp時，這個操縱子自動關閉，缺乏Trp時操縱子被開啟，trp基因表達，Trp或與其代謝有關的某種物質在阻遏過程中起作用。Trp操縱子的調控機制主要有兩種：1）阻遏作用：trp操縱子轉錄起始的調控是通過Trp阻遏蛋白實現的。在色氨酸的存在下，它結合到Trp抑制子上，誘導該蛋白構象改變，可結合於操縱基因，抑制結構基因的表達。但該負調控的能力相對較低，此過程中色氨酸為輔阻遏物。2）衰減作用：trp操縱子轉錄終止的調控是通過衰減作用實現的。原核生物轉錄翻譯偶聯，當轉錄開始後一段時間，若中Trp水平較高，核糖體迅速地翻譯出前導序列中的序列1，生成14肽，並佔據序列2區域，使前導序列轉錄產物3和4互補，形成類似終止子的衰減子結構；如果Trp水平較低，核糖體在序列1處翻譯出9肽產物，使得序列2和3互補，阻止了衰減子的形成，使轉錄繼續進行。通過Trp的濃度在轉錄、翻譯2個層次調節基因表達。

9.細菌營養環境極差（如缺乏氨基酸）時如何進行應急反應？細菌營養環境極差（如缺乏氨基酸）時如何進行應急反應？

氨基酸在缺乏氨基酸的環境下，細菌會停止大部分活動，應急反應會使RNA水平降低5~10%，使兩種訊號素ppGpp及pppGpp聚集，它們通過與靶蛋白的結合來改變其活性。未負載的tRNA與A位點結合，觸發應急反應，RelA被活化，合成（p）ppGpp，它們降低了某些基因如rDNA的轉錄或者是增加另一些基因的轉錄，部分是因為改變了與RNAP的結合及改變RNAP啟動子的特異性。

10.細菌如何利用Riboswitch調控基因表達？調控基因表達？

核糖開關常包含兩個結構域：適體結構域(AD)及表達結構域(EPD)。調控機制：核糖開關的適體結構域與小分子結合，傳達到表達結構域，進而在轉錄或翻譯水平調控基因的表達。該調控主要通過改變RNA的二級結構來完成的。概括地說，存在兩種機制：核糖開關的作用域由序列1-4四部分組成1）在SAM存在的狀況下，區域1和2配對，區域3和4形成柄環結構，產生了一個髮夾終止子，使RNAP在此終3止轉錄；如果SAM不存在，則區域2和3配對形成柄環結構，轉錄得以進行。2）SAM存在的前提下，在區域3和4形成的柄環結構封閉了核糖體的結合位點RBS而使翻譯起始阻止；沒有SAM，則區域2和3形成柄環，翻譯起始繼續進行。在翻譯起始階段，使得RBS序列處於互補區或單鏈區，來決定核糖體能否結合，從而決定翻譯的起始，最終實現對基因表達的調控。

11.細菌如何調控translationinitiation？？

簡言之，細菌在轉錄起始主要通過調控蛋白對其調控1)一種RNA結合蛋白結合到mRNA上的RBS上，通過阻止核糖體小亞基的結合，來抑制了翻譯的起始；2）mRNA分子通過鹼基配對自身回折形成二級結構來對翻譯起始階段進行調節3）通過rRNA的濃度控制是否與r-protein組裝成核糖體，進而調控轉錄。當存在充足的rRNA時，r-protein翻譯後與之結合生成核糖體，起始翻譯，反之生成的r-protein則與自身mRNA結合，抑制自身翻譯。

12.簡述細菌sRNAs的結構特徵、產生機制及功能。的結構特徵、產生機制及功能。特點：其sRNA比真核生物的小分子RNA大很多，為80~110nt；產生機制：由基因直接編碼形成其最終產物，而不是由大分子RNA的前體加工而成；功能：大多數sRNA與靶mRNA互補使其降解，抑制翻譯，也有促進翻譯的報道。1）sRNA可與和RBS互補的序列配對，釋放RBS，進而啟用翻譯；2）sRNA也可以與RBS序列互補配對，抑制核糖體的結合，抑制翻譯。

13.簡述λrepressor&Croprotein的作用（action）的作用（）。

λrepressor：維持溶源性途徑。PRM作為CI的啟動子，可以結合RNAP，最終編碼λrepressor。λrepressor二聚化後與OR1結合，該結合通過協同作用又促進了與OR2的結合，由於OR2與PR和PRM有overlap，使得λrepressor的結合阻礙了RNAP與PR的結合，阻礙了立即早期基因的轉錄，而對其本身的PRM來說則可以募集RNAP，促進RNAP與PRM結合，使其進一步表達λrepressor，形成一個正調控反饋，維持溶源狀態；Croprotein：維持溶菌性途徑。Cro與OR3的親和力最高，Cro形成二聚體後，首先與OR3結合，而OR3與PRM有overlap，這樣就阻礙了RNAP與PRM的結合，限制了CI的λrepressor表達，從而無法抑制RNAP與PR的結合，使得Cro蛋白表達，維持溶菌狀態

14.簡述λ噬菌體Establishmentoflysogeny的過程。的過程。

CI有兩個啟動子，PRE和PRM。在感染早期，由於PRE太弱，首先需要cⅡ表達CⅡ蛋白，CⅡ蛋白作為啟用劑，結合在相當於PRE的-35區的cII結合位點上，這樣幫助募集PRE的RNAP，從而啟用CI的表達，生成λrepressor；之後λrepressor結合到OR上，募集PRM的RNAP，來維持溶源狀態當建立了溶源性時，cⅠ基因從PRE開始轉錄，當這一狀態得以維持時，cⅠ基因從PRM開始轉錄，產生λrepressor，結合在OR1和OR2上，激活了維持模式的表達(PRM)並且關閉了建立模式的表達(PRE)。宿主菌的生長情況關係到FtSH水解酶的活性，而CⅡ蛋白是FtSH水解酶的底物。若生長良好，FtSH水解酶有活性，可以裂解CⅡ蛋白,Cro蛋白保留，進入溶菌途徑。反之選擇溶源途徑。

15.簡述N蛋白和Q蛋白的抗終止機制。

N蛋白調控早期的基因表達，作用於3個終止子，它阻止在λ早期操縱子的終止，其作用的位點為nut。RNAP一通4過nut位點，N蛋白即結合到RNA上，並通過RNA裝載到RNAP上。在這種狀態下，RNAP可以抵抗N和cro以外的終止子。N結合在RNA上的BoxB上，作用於立即早期基因的終止子tR結構上，形成抗終止複合物，使得轉錄得以繼續進行，是進入延遲早期基因所必須的；Q蛋白識別於晚期啟動子PR’-10和-35區之間的DNA序列QBE。無Q時，RNAP結合並起始轉錄，但在進行僅16或17nt後暫停，然後終止於下游約200bp的終止子tR’；如果Q存在，RNAP一離開啟動子，Q就結合QBE，並移動到在附近停留的RNAP，RNAP裝載了Q蛋白就能通過tR’。是晚期基因完成轉錄所必須的。

二．Generegulationineukaryotes複習題（一）複習題

Ⅰ名詞解釋

mosome染色體，基因組的一個相對獨立的單位，是遺傳物質基因的載體。每個染色質都是有一個雙螺旋DNA和其質量相當的蛋白質組成；僅在細胞有絲分裂期是可見其形態。

matin染色質由DNA和蛋白質組成，存在於真核生物細胞核內，處於分裂間期的一種DNA的存在形式。

-hybridassay雙雜交法，用來判斷蛋白是否相互作用的方法，編碼蛋白A的基因與編碼Gal4DNA結合結構域的片段融合，編碼蛋白B的基因與編碼活化結構域的片段融合，當兩種融合蛋白在細胞中同時表達，且AB蛋白之間產生相互作用，則會產生一個完整的啟用蛋白，使報告基因表達,即可檢測是AB蛋白間是否有相互作用。

matinImmunoprecipitation(ChIP)染色質免疫沉澱，用來判斷給定蛋白與細胞內基因組DNA的結合部位。其主要步驟為：1)蛋白質A與特定的DNA序列相結合，用甲醛固定，使這種結合狀態穩定；2)細胞裂解，超聲破碎DNA至其片段在200-300bp間；3)加入A蛋白的抗體a,利用沉澱技術將抗體a-蛋白質A-DNA複合物分離出來4)利用解交聯技術使得DNA與蛋白質A、抗體a分離，即得到與蛋白質A特異性結合的DNA；5)利用PCR技術擴增出特異片段就可確定結合的位點。

odomain布羅莫結構域，實際上是真核生物中的一種蛋白模體，發現於果蠅brm基因的表達產物而命名，它存在於參與染色質活化或促進有絲分裂訊號作用等核蛋白中，含有61~63（或~110）個保守氨基酸，識別並結合乙醯化的Lys，介導蛋白質間的相互作用，並募集重要的功能複合物。

modomain克羅莫結構域，即染色質結構修飾結構域，是一種真核生物的蛋白模體，高度保守，含30~50個氨基酸，結合甲基化的Lys殘基，存在於動、植物細胞核內參與調節染色質結構的若干蛋白質中。

lators絕緣子，通常位於增強子同啟動子之間，其本身對基因的表達沒直接效應，與絕緣子結合的蛋白質既不抑制啟動子的活性，也不抑制啟用蛋白的活性，它們只是阻礙兩者之間的聯絡，其作用是避免遠距離作用的非特異性，使增強子只能對特異的啟動子發揮作用，還可以阻斷影響基因表達的染色質修飾複合物的擴散，無需結合阻遏蛋白即可關閉某些基因的表達。其作用具有方向性。

scontrolregion基因座控制區，有許多增強子或絕緣子元件組成，它可以控制個體基因的有序表達，但機制未知。可能通過募集染色質重塑複合物或者使通過募集轉錄機器來行使其功能。

cluster基因簇，一組緊密連鎖的且功能上密切相關的結構基因。

rsensitivesites高敏位點，染色質中比較短的區域，由於對DNaseI和其他核酸酶極其敏感而被發現，包括除核小體外的區域，這些區域都是轉錄的活性區域。

ekeepinggenes管家基因，對於細胞生存必不可少的組成性表達基因，市在所有細胞都表達的基因，它們為所有型別的細胞提供基本的功能需求。

inationalcontrol組合調控，多個啟用蛋白的協同作用或啟用蛋白跟抑制子的相互作用對轉錄的調控為組合調控，不同的組合保證各類細胞表達不同的基因。

tivator輔啟用蛋白，通常指任何輔助性啟用蛋白質，它們不是轉錄機器的一部分，本身也不是DNA結合的調節蛋白，但是卻參與基因的轉錄調節，此概念也指其它對核小體具有修飾功能的複合物，可能是組蛋白甲基化酶或者其它的核小體修飾複合物。在輔啟用蛋白的作用下，可以促進轉錄。

pressor輔阻遏蛋白，通常指任何輔助性阻遏蛋白質，它們不是轉錄機器的一部分，本身也不是DNA結合的調節蛋白，但是卻參與基因的轉錄調節，此概念也指其它對核小體具有修飾功能的複合物，可能是組蛋白甲基化酶或者其它的核小體修飾複合物。在輔阻遏蛋白的作用下，可以抑制轉錄。

Ⅱ簡答

1．真核與原核的activator的募集作用有何區別的募集作用有何區別？原核啟用蛋白結合到DNA上且與RNAP相互作用，直接將RNAP募集到基因上。真核生物的啟用蛋白也以這種方式作用，但是募集是間接的。真核生物的啟用蛋白通過染色體重塑複合物、乙醯轉移酶、中介體複合物的介導來募集RNAP.在真核中1）啟用蛋白募集轉錄機器某些組分，這些組分再募集RNAP；2）啟用蛋白能募集核小體修飾成分來間接募集RNAP，即改變染色質的結構，使轉錄區活化，幫助RNAP結合：A:募集依賴ATP的染色體重塑複合物；B：不依賴ATP的一些酶，如HAT3）啟用蛋白可以募集轉錄所需的某些蛋白因子，如通用轉錄因子等。

indingmotif的recognitionstrategy是如何進化的？舉例說明。是如何進化的？舉例說明。

DNA結合結構域在進化上有兩個分支:(1)以α螺旋的形式嵌入到DNA大溝中，如原核生物中的HTH，以及真核生物中較常見的四類DNA結合結構域：鋅指結構，亮氨酸拉鍊，HLH(螺旋-環-螺旋)，同源異型域；(2)大量的調節蛋白在進化上有另外一個完全不同的識別策略，即利用雙鏈的?-sheet與DNA結合，以一對反平行摺疊插入到DNA中，例如細