微生物量：微生物大小及數量的測定
微生物大小及數量的測定
一、實驗目的
1.學習並掌握用測微尺測定微生物細胞大小的方法。2.瞭解血細胞計數板的構造及計數原理。
3.掌握使用血細胞計數板進行微生物計數的方法。
二、實驗原理
1.微生物大小測定原理
微生物細胞的大小是微生物的形態特徵之一，也是分類鑑定的依據之一。其測量工具有目鏡測微尺和鏡臺測微尺。鏡臺測微尺是中央部分刻標準刻尺的載玻片，其尺度總長為1mm，精確分為10個大格，每個大格又分為10個小格，共100小格，每一小格長度為0.01mm，即10μm。如圖1。
圖1鏡臺測微尺中央部分及鏡臺測微尺校正目鏡測微尺
目鏡測微尺，如圖2，是一塊可放入接目鏡內的圓形小玻片，其中央有精確的等分刻度，一般有等分為50小格和100小格兩種。測量時，需將其放在接目鏡中的隔板上，用以測量經顯微放大後的細胞物象。由於不同顯微鏡或不同的目鏡和物鏡組合放大倍數不同，目鏡測微尺每小格在不同條件下所代表的實際長度也不一樣。
圖2目鏡測微尺
2.血球計數板測定微生物數量的原理血細胞計數板是一塊特製的載玻片，其上由4條槽構成3個平臺。中間較寬的平臺又被一段橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各刻有一個方格網，每個方格網共分9個大方格，中間的大方格即為計數室。計數室的刻度一般有兩種規格，一種是一個大方格分成25
箇中方格，
而每個中方格又分成16小方格（圖5-2）；另一種是一個大方格分成16箇中方格，而每個中方格又分成25個小方格，但無論是哪一種規格的計數板，每一個大方格中的小方格都是2400個。每一個大方格邊長為1mm，則每一個大方格的面積為1mm，蓋上蓋玻片後，蓋玻片
3與載玻片之間的高度為0.1mm，所以計數室的容積為0.1mm（10-4mL）。以25箇中方格的計數板為例，設5箇中方格中的總菌數為A，菌液稀釋倍數為B，則：
1mL菌液中的總菌數=A/5×25×10×B圖3血球計數板側面及兩種型別的計數室
三、實驗
1.菌種枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)斜面培養物；釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)液體培養基培養物。
2.溶劑和試劑
合成培養基（酵母菌液），稀釋的美藍染液（0.01%），95%酒精，二甲苯溶液，香柏油，無菌水
3.儀器和其他用品
血球計數板，顯微鏡，載玻片，酒精燈，接種環，蓋玻片，擦鏡紙，鏡臺測微尺，目鏡測微尺，無菌毛細滴管，雙層瓶，計數器
四、實驗步驟
1、微生物大小的測定（1）裝目鏡測微尺
取出接目鏡，把目鏡上的透鏡片旋下，將目鏡測微尺刻度朝下放在目鏡鏡筒內的隔板上，然後旋上目鏡透鏡，再將目鏡插入鏡筒內。（2）校正目鏡測微尺
①放鏡臺測微尺
將鏡臺測微尺刻度面朝上放在顯微鏡載物臺上。②校正
先用低倍鏡觀察，將鏡面測微尺有刻度的部分移至視野中央，調節焦距，當清晰的看到鏡臺測微尺的刻度後，轉動目鏡使目鏡測微尺的刻度與鏡臺測微尺的刻度平行。利用移動器移動鏡臺測微尺，使兩尺在某一區域內兩線完全重合，然後分別數出兩重合線之間鏡臺微尺和目鏡微尺所佔的格數
③計算
由於已知鏡臺測微尺每格長10μm，根據下列公式即可分別計算處在不同放大倍數下，目鏡測微尺每個所代表的長度。
目鏡測微尺每個長度（μm）=
用同樣的方法換成高背景和油鏡進行校正，分別測出在高倍鏡和油鏡下，兩重合線之間兩尺分別所佔的格數。(注意：觀察時光線不宜過強，否則難以找到鏡臺微尺的刻度；換高倍鏡和油鏡校正時，務必十分細心，防止接物鏡壓壞鏡臺微尺和損壞鏡頭。)（3）對枯草芽孢桿菌用簡單染色法制片（4）菌體大小的測定
①枯草芽孢桿菌大小的測定
目鏡測微尺校正完畢後，取下鏡臺測微尺，換上細菌染色製片。先用低倍鏡和高倍鏡找到標本後，換油鏡測枯草芽孢桿菌的寬度和長度。測定時，通過轉動目鏡微尺和移動載玻片，測出細菌直徑或寬和長所佔目鏡測微尺的格數。最後將所測得的格數乘以目鏡測微尺（用油鏡時）每格所代表的長度，即為該菌的實際大小
②酵母菌大小的測定測定酵母菌時，先將酵母菌培養物製成水浸片，然後用高倍鏡或油鏡測出寬和長各佔目鏡微尺的格數，最後，將測得的格數乘上目鏡微尺（用高倍鏡或油鏡時）每格所代表的長度，即為酵母菌的實際大小（注意：可選擇有代表性的3~5個細胞進行測定；細菌的大小需用油鏡測定，以減少誤差）
（5）測定完畢，取出目鏡測微尺後將接目鏡放回鏡筒，再將目鏡測微尺和鏡臺測微尺分別用擦鏡紙擦拭乾淨，放回盒內儲存。2、顯微鏡直接計數法（1）鏡檢計數室
在加樣前，先對計數板的計數室進行鏡檢。若有汙物，則需清洗，吹乾後才能進行計數。（2）加樣品
將清潔乾燥的血細胞計數板蓋上蓋玻片，再用無菌的毛細滴管將搖勻的釀酒酵母菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自動進入計數室，一般計數室均能充滿菌液（注意：要搖勻菌液；加樣時計數室不可有氣泡產生）（3）顯微鏡計數
5min，然後將血細胞計數板置於顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計數室所在位置，然後換成高倍鏡進行計數。調節顯微鏡光線的強弱適當，對於用反光鏡採光的顯微鏡還要注意光線不要偏向一邊，否則視野中不易看清楚計數室方格線，或只見豎線或只見橫線。（4）清洗血細胞計數板
完畢後，將血細胞計數板在水龍頭用水沖洗乾淨，切勿用硬物洗刷，洗完後自行晾乾，鏡檢，觀察每小格內是否有殘留菌體或其他沉澱物。若不乾淨，則必須重複洗滌至乾淨為止。
五、實驗結果
1．菌體大小的測量
(1)目鏡測微尺校正結果
(2)枯草芽孢桿菌測量結果（油鏡觀察，所得資料為所佔格數）
(3)釀酒酵母測量結果（油鏡觀察，所得資料為所佔格數）
(4)測量結果換算
2、顯微鏡直接計數法（血球計數板）結果
六、思考題
1．為什麼更換不同放大倍數的目鏡或物鏡時，必須用鏡臺微尺重新對目鏡測微尺進行校正？答：因為目鏡測微尺每格代表的長度與物鏡倍數不是成比例的增加
2．在不改變目鏡和物鏡測微尺，而改用不同放大倍數的物鏡來測定同一株細菌的大小時，其測定結果是否相同？為什麼？
答：相同。因為改變物鏡放大倍數後，只要經校正計算出正確的目鏡測微尺每格代表的.長度，再進行測量，經計算都會得到菌的實際大小。
3．根據你的體會，說明用血細胞計數板計數的誤差主要來自哪些方面?應如何儘量減少誤差．力求準確?
答：①樣品的濃度要適中，太濃則不易計數，太稀也會導致計數不準確。另外稀釋時要精確。
②樣品稀釋後要搖勻，否則計數板每個格內的細菌數菌量分佈不均，會造成較大誤差。
4．某單位要求知道一種乾酵母粉中的活菌存活率，請設計1～2種可行的檢測方法。
答：將乾酵母粉製成酵母菌液，取少量菌液於試管內並加入少量美藍染液進行混合，然後在血球計數板進行觀察計數，算出所有死活菌的總數量，然後觀察計數變藍的死的菌量，兩者比就是乾酵母粉中的活菌存活率。
七、實驗小結
本實驗成功的關鍵是：
1.使用鏡臺測微尺進行校正時，若一時無法直接找到測微尺，可先對刻尺外的圓圈線進行準校後再通過移動標本推進器進行尋找。
2.細菌在不同的生長時期細胞大小有時會有較大變化，注意選擇處於對數生長時期的細胞材料。
3.實驗中進行顯微計數時應先在低倍鏡下尋找大方格的位置，找到計數室後將其移至視野中央，再換高倍鏡觀察和計數。
通過此次實驗，我們瞭解了血細胞計數板的構造及計數原理，掌握了用測微尺測定微生物細胞大小和使用血細胞計數板進行微生物計數的方法，鞏固了微生物實驗技能。
