動物微生物及免疫學實驗的報告
一、實驗目的
（一）掌握一般培養基的製備原理及要求，掌握培養基酸鹼度的測定，熟悉一
般培養基的製備過程和各種器皿滅菌方法。
（二）掌握細菌分離培養的基本要領和方法，掌握細菌抹片的製備方法和革蘭
氏染色法及油鏡的使用方法，並認識革蘭氏染色的反應特性。
二、實驗用品
（一）器材
量筒、燒杯、電子天平、漏斗、三角燒瓶、空試劑瓶、玻璃棒、玻璃平皿、刻度吸管、pH試紙、紗布、脫脂棉、天平、電爐、試劑瓶瓶塞、扎繩、放大鏡、包裝紙、洗耳球、酒精燈、載玻片、火柴、吸水紙、剪刀、記號筆、接種環、注射器、鑷子、鉗子、毫米尺、培養箱、水浴培養箱、高壓蒸汽滅菌鍋、油鏡
（二）試劑及材料
肘腖、蛋白腖、豬膽鹽、氯化鈉、瓊脂、乳糖、0.01%結晶紫水溶液、0.5%中性紅水溶液、血清、胰化蛋白腖、酵母提取物、氫氧化鈉、鹽酸、牛血清、革蘭氏染色液、蒸餾水、小白鼠、病豬內臟
三、實驗步驟
（一）培養基的製備
（所有用到的器皿都已121℃高壓滅菌15~30min，傾注平板在無菌操作檯內完成，並放在無菌操作檯內）
1、麥康凱培養基
（1） 組成：蛋白腖17g、肘腖3g、豬膽鹽5g、氯化鈉5g、瓊脂17g、乳糖
10g、0.01%結晶紫水溶液10ml、0.5%中性紅水溶液5ml、蒸餾水1000ml
（2） 方法：將蛋白腖、肘腖、豬膽鹽和氯化鈉溶解於400ml蒸餾水中，調節
pH至7.2。將瓊脂加入600ml蒸餾水中，並加入乳糖，加熱熔化。將兩
液混合，分裝於燒瓶內，用紗布、扎繩等捆好後，121℃高壓滅菌
15~30min。待冷卻至50~ 55℃時，加入結晶紫和中性紅水溶液，搖勻後
傾注平板。
注：結晶紫和中性紅水溶液配好後需經高壓滅菌。
2、血清平板
（1） 組成：營養瓊脂、牛血清
（2） 方法：將滅菌的營養瓊脂加熱熔化，冷卻至45~50℃時，加入牛血清，並
混勻，傾注平板。
注：不得將牛血清一併加入後再滅菌。
3、LB培養基
（1） 組成：胰化蛋白腖10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g、瓊脂15g
（2） 方法：在950ml蒸餾水中加入胰化蛋白腖、酵母提取物、瓊脂和氯化鈉，
調節pH至7.4，加熱熔化，分裝於瓶中，用紗布、扎繩等捆好後，121℃高壓滅菌15~30min。待冷卻至50~ 55℃時，傾注平板。
4、液體培養基（在LB培養基的基礎上，裝入大試劑瓶中，不加瓊脂，不分裝）
（二）病料取材
在病豬死亡後，首先用顯微鏡檢查其末梢血液膜片中是否有炭疽桿菌存在，未發現，則立即用消毒的器械對其進行生理解剖，觀察其病理特徵現象，取出病豬的十二指腸、胃、肝臟三處的組織物，並注意組織的完整性，用儲物袋密封儲存。
（三）細菌粗培養
1、消毒滅菌：操作人員先用消毒水清洗手或戴好實驗手套，再用消毒水對無菌操作檯內桌面及用酒精燈外焰對待用器械進行火焰滅菌。
2、接種
（1） 在無菌操作檯酒精燈旁開啟用儲物袋密封儲存的病料，先左手持鑷子右
手持剪刀，把病料剪出一個小口。
（2） 右手持滅過菌的接種環，左手持平板，並用拇指、食指及中指將平皿揭
開約20左右，然後將接種環前端插入小口旋轉一下後，再用劃線接種的方法接種到一個血清平板上。
（3） 用記號筆在平板底部作好日期、操作人員、部位等標記，並將平板倒放。
以此方法，分別接種十二指腸、胃粘膜、肝臟於血清平板上，各接種2個血清平板。
3、培養：將接種好的血清平板倒扣放入37℃培養箱中，反向培養24小時。 注：劃線接種時儘量劃開，以保證長出單個菌落，且劃線時接種環應儘量傾斜，以免劃破培養基（後同）；待接種完畢後熄滅無菌操作檯內酒精燈，關閉好無菌操作檯視窗，開啟無菌操作檯內的紫外燈。 。
（四）細菌純培養
1、菌落特徵判斷
待粗培養的細菌培養24小時後，取出用放大鏡觀察記錄單個小菌落的形態特徵並用實驗報告紙記錄好，並在平板底部上做好觀察標記，其形態特徵包括大小、形狀、菌落邊緣、表面構造、隆起度、溼潤度、透明度、顏色等。
2、取單個菌落進行革蘭氏染色鏡檢
（1） 取乾淨的載玻片，用記號筆在其一面做好正反面標記，再在載玻片另一
面中央滴上一小滴蒸餾水。
（2） 將接種環在火焰上滅菌，待冷卻後，在酒精燈旁從標記的.單個小菌落中
取少許細菌置於蒸餾水中混勻（同時蓋好平板倒扣置於一旁），用接種環塗成直徑約1.5cm的菌膜，再在酒精燈火焰上方以鐘擺速度通過固定好細菌，待冷卻進行染色。
（3） 先滴加草酸結晶紫溶液染色1~2min，再水洗；然後滴加革蘭氏碘液溶液
染色1~2min，再水洗；隨後滴加95%的酒精脫色30~60s，再水洗；最後滴加稀釋的品紅進行復染30~60s，再水洗；待乾燥或吸水紙吸乾後鏡檢。
（4） 將乾燥的載玻片放在1000倍油鏡下，滴加一滴松柏油進行鏡檢，觀察其
形態特徵，判斷細菌的種屬。
3、細菌接種培養
（1） 消毒滅菌：操作人員先用消毒水清洗手或戴好實驗手套，再用消毒水對
無菌操作檯內桌面及用酒精燈外焰對待用器械進行火焰滅菌。
（2） 接種：右手持滅過菌的接種環，左手持平板，並用拇指、食指及中指將
平皿揭開約20左右，然後將接種環插入揭開的平板口內蘸去一下鏡檢標記的小菌落，再用劃線接種的方法接種到一個血清平板、LB平板或麥康凱平板上。並用記號筆在平板底部作好日期、操作人員、菌種、部位等標記，將平板倒放。
（3） 將接種好的平板倒扣放入37℃培養箱中，反向培養24小時。
注：油鏡用完後應立即清理物鏡上的松柏油；劃線接種時儘量劃開，以保證長出單個菌落；待接種完畢後熄滅無菌操作檯內酒精燈，關閉好無菌操作檯視窗，開啟無菌操作檯內的紫外燈。 。
（五）菌液的製備
1、鏡檢：用革蘭氏染色法在1000倍油鏡下鏡檢，觀察並記錄是否為純培養的細菌。
2、分裝液體培養基：先對無菌操作檯及需要使用的器械進行消毒滅菌，然後用鉗子揭開一個空試劑瓶，用傾倒的方法在酒精燈旁從液體培養基大試劑瓶中分裝於空試劑瓶內，並立即蓋上液體培養基大試劑瓶瓶塞。
3、接種：右手持接種環，用火焰對其進行滅菌，待冷卻後，取出純培養的平板，在無菌操作檯內酒精燈旁，蘸去少許細菌，左手傾斜液體培養基，將接種環，伸入液體培養基內攪動，然後取出對接種火焰環滅菌，並用滅菌的包裝紙捆綁好後，用記號筆做好相應標記，置於一旁。
4、培養搖菌：將接種好的液體培養基置於水浴培養箱中培養24小時。 注：分裝一個培養基就接種一個培養基，不得全部分裝完後再一個一個接種。
（六）小鼠致病性實驗
1、保定：選擇健康的青壯年小白鼠，先用右手抓住尾巴，旋轉數週讓其眩暈，然後用左手的拇指和食指捏住兩耳及頭部面板，並翻轉左手，使其頭部朝下，以達到內臟前移的目的。
2、接種：先用酒精棉球蘸取酒精對注射部位擦洗消毒，再用注射器注射吸取0.2ml菌液注射於小白鼠腹腔中。
3、觀察：將接種的小白鼠放在適宜的環境下生活，並在鼠籠處用記號筆標記好接種時間、菌種等。
4、再培養鑑定：待小白鼠死亡後，對其進行解剖，觀察其內臟病變情況，並取肝臟直接塗在相應培養基上，在適宜條件下反向培養24小時後，取菌落細菌進行鏡檢觀察判斷。
注：在注射小白鼠2小時候需要觀察小白鼠是否因注射時傷害到內臟而死亡。
