關於微生物氮的介紹
微生物氮篇一：微生物和氮素迴圈
第九章
在自然界，生物不斷地從環境中吸收它們生長髮育所必需的C、H、O、N、S、P等各種營養元素。但是，這些營養元素在自然界的總量是有限的，而生命的延續是無限的，只有這些元素的迴圈使用，生物界不斷向前發展。促進這些物質迴圈的作用有物理作用、化學作用和生物作用，其中生物是起主導作用的，而微生物是自然界物質迴圈的主要推動者，在自然界物質迴圈中起著非常重要的作用。本文主要介紹了微生物在氮素迴圈中的作用。
關鍵詞：固氮氨化硝化同化反硝化
2微生物在氮素迴圈中的作用
氮是核酸和蛋白質的主要成分，是構成生物體的必需元素。雖然佔大氣體積78%的氣體是N2，但所有動植物和大多數微生物都不能直接利用N2。作為自然界最重要的初級生產者的植物所需要的氮?銨鹽、硝酸鹽等無機氮化物，在自然界為數不多，只有將大氣中的N2進行轉化和迴圈，才能滿足植物體對氮素的需要。氮素迴圈包括微生物的固氮作用、氨化作用、硝化作用、反硝化作用以及同化作用，這其中的每一種作用都離不開微生物的參與。
2.1固氮作用
分子態氮被還原成氨或其它氮化物的過程稱為固氮作用。自然界氮的固定有兩種方式，一是非生物固氮，即通過雷電、火山爆發和電離輻射等固氮以及人工合成氨，非生物固氮形成的氮化物在數量上遠不能滿足自然界生物生長的需要；二是
生物固氮，即通過微生物的作用固氮，自然界生物生長所需要的氮大部分通過這種作用提供。生物固氮不僅經濟，而且不破壞環境，在N2的轉化中佔有重要地位。湖水沉積物中含有大量的固氮菌(Peptea,1993)，能夠固氮的微生物均為原核生物，主要有細菌、放線菌和藍細菌(徐孝華,1991)。
2.2氨化作用
微生物分解含氮有機物產生氨的過程稱為氨化作用。氨化作用在農業生產中十分重要，施入土壤中的各種動植物殘體和有機肥，包括綠肥、堆肥和廄肥都含有豐富的.含氮有機物。這些有機物須通過各類微生物的作用，將其氨化後才能被植物吸收和利用。水中的氨化細菌有助於水體中氮的迴圈和水的清潔，湖的底泥中氨化細菌相當活躍(Genovese,1994)。
2.3硝化作用
微生物將氨氧化成硝酸鹽的過程稱為硝化作用。硝化作用是自然界氮素迴圈中不可缺少的一環。硝化作用分兩個階段進行，每個階段都離不開微生物的作用。第一階段是氨在亞硝化細菌的作用下被氧化為亞硝酸鹽。第二階段是亞硝酸鹽在硝化細菌的作用下被氧化為硝酸鹽。土壤中固氮細菌的數量多於硝化細菌(金鈞然,1991)。
2.4同化作用
銨鹽和硝酸鹽是植物和微生物良好的無機氮類營養物質，它們可被植物和微生物吸收利用，合成氨基酸、蛋白質、核酸和其它含氮有機物。湖泊中具有同化作用的細菌有助於淡水魚對蛋白質的利用(Shivokene,1996)。
2.5反硝化作用
微生物還原硝酸鹽，釋放出分子態氮和/或N2O的過程稱為反硝化作用或脫氮作
用。反硝化作用是造成土壤氮素損失的重要原因之一。反硝化作用一般只在厭氧條件下進行，在農業生產上常採用中耕鬆土的辦法抑制反硝化作用。從整個氮素迴圈來說，反硝化作用是有利的。水體中的反硝化細菌有助於碳的迴圈(宋金明,2000)。湖水沉積物中含有大量的反硝化細菌，如果沒有反硝化作用，自然界的氮素迴圈就會被中斷，硝酸鹽將會在水體中大量蓄積，對人類的健康和水生生物的生存就會造成極大的威脅(Peptea,1998)。
微生物氮篇二：凱氏定氮法：土壤微生物量氮測定
土壤微生物量氮的測定方法
1.試劑配製：
(1)混合催化劑：按照硫酸鉀：五水硫酸銅：硒粉=100：10：1，稱取硫酸鉀100g、五水硫酸銅10g、硒粉1g。均勻混合後研細,貯於瓶中。
(2)密度為1.84濃硫酸。
(3)40%氫氧化鈉：稱400g氫氧化鈉於燒杯中，加蒸餾水600ml，攪拌使之全部溶解定容至1L。
(4)2%硼酸溶液：稱20g硼酸溶於1000ml水中，再加入20ml混合指示劑。（按體積比100:2加入混合指示劑）
(5)混合指示劑：稱取溴甲酚綠0.5g和甲基紅0.1克,溶解在100ml95%的乙醇中,用稀氫氧化鈉或鹽酸調節使之呈淡紫色，此溶液pH應為4.5。
(6)0.01mol的鹽酸標準溶液：取比重1.19的濃鹽酸0.84ml，用蒸餾水稀釋至1000ml，用基準物質標定之。
(7)0.5MK2SO4溶液：稱取K2SO487.165g溶解於蒸餾水中，攪拌溶解，（可加熱）定容至1L。
(8)去乙醇氯仿的配製：在通風櫃中，量取100毫升氯仿至500毫升的分液漏斗中，加入200毫升的蒸餾水，加塞，上下振盪10下，開啟塞子放氣，而後加塞再振盪10下，反覆3次，將分液漏斗置於鐵架臺上，靜止溶液分層，開啟分液漏斗下端的閥，將下層溶液（氯仿）放入200毫升的燒杯中，將剩餘的溶液倒入水槽，用自來水沖洗。再將燒杯中的氯仿倒入分液漏斗中，反覆3次。將精製後的氯仿倒入棕色瓶中，加入無水分析純的CaCl210g，置於暗處儲存。
2.試驗步驟：。
（1）制樣：稱取新鮮土壤（30.0g）於放置燒杯中，加約等於田間持水量60%水在25℃下培養7~15d。取15.0g土於燒杯，置於真空乾燥器中，同時內放一裝有用100ml精製氯仿的小燒杯，密封真空乾燥器，密封好的真空乾燥器連到真空泵上，抽真空至氯仿沸騰5分鐘，靜置5分鐘，再抽濾5分鐘，同樣操作三次。乾燥器放入25℃培養箱中24小時後，抽真空15-30分鐘以除盡土壤吸附的氯仿。按照土：0.5MK2SO4=1:4(烘乾土算，一般就是溼土：0.5MK2SO4=1：2)，加入0.5MK2SO4溶液（空白直接稱取15.0g土，加同樣比例0.5MK2SO4溶液）震盪30分鐘，過濾。
（2）測定：濾液要是不及時測定，需立即在-15℃以下儲存，此濾液可用於微生物碳氮的測定。微生物碳測定只吸取2ml，採用重鉻酸鉀-硫酸亞鐵滴定法測定。微生物氮吸取濾液10ml於消化管中，加入2g催化劑，在再加5ml濃硫酸，管口放一彎頸小漏斗，將消化管置於通風櫥內遠紅外消煮爐的加熱孔中。開啟消煮爐上的所有加熱開關進行消化，加熱至微沸，關閉高檔開關，繼續加熱。消煮至
溶液呈清徹淡藍色，然後繼續消煮0.5—1.0h，最後溶液呈藍綠色，土呈灰白色，全部消煮時間約85一90min。消煮完畢冷卻，同時做兩個試劑空白試驗。
（3）計算：
A．氮含量計算
土壤含氮量（%）=(V-V0)*N*0.014*100*ts/W
V-滴定試樣時消耗的鹽酸標準溶液體積，ml。
V0-滴定空白時消耗的鹽酸標準溶液體積，ml。
N-鹽酸標準溶液的當量濃度。（此處為0.01）
W-土壤樣品重（用水分系數換算成烘乾土重）g。
0.014-氮的毫克當量
ts為分取倍數，濾液為30ml，試驗測定用了10ml，因此處ts為3
B．微生物氮計算
B(N)=EN／KEN
式中B(N)——微生物量氮（BN）質量分數，-1；
EN——燻蒸土樣浸提的全N與未燻蒸土樣之間的差值，-1；（取上述A燻蒸和未燻蒸全氮的差值）
KEN—代表被氯仿燻蒸殺死的土壤微生物生物量碳在培養期間礦化為礦質態氮的比例，常取0.57（Jenkinson.1988）
注：所有的濾液測定參考的方法為：陳立新《土壤實驗實習教程》，步驟和燻蒸前期處理參考：吳金水《土壤微生物生物量測定方法及其應用》，所有的藥品全是分析純，若土壤比較貧瘠可在消煮的時候加多點浸提液。
微生物氮篇三：土壤微生物量碳氮的測定
土壤微生物量的測定
一、土壤微生物生物量碳（氯仿燻蒸－K2SO4提取－碳自動分析法）
1、試劑配製
（1）去乙醇氯仿製備：市售氯仿一般含有少量乙醇作為穩定劑，所以，使用前必須將其中的乙醇去掉。方法是量取適量的分析純氯仿，按1?2（v:v）的比例與蒸餾水或去離子水一起放入分液漏斗中，充分搖動1min，慢慢放出底層氯仿於燒杯中，如此洗滌3次。得到的無乙醇氯仿中加入無水氯化鈣，以除去氯仿中的水分。純化後的氯仿置於暗色試劑瓶中，在低溫（4℃）、黑暗狀態下儲存。注意：氯仿具有致癌作用，所有操作必須在通風櫥中進行。
（2）氫氧化鈉溶液[c（NaOH）=1molL-1]
（3）硫酸鉀浸提劑[c（K2SO4）=0.5molL-1]：取1742.6g分析純硫酸鉀，用研缽磨成粉末裝，倒於25L塑料桶中，加蒸餾水至20L，蓋緊螺旋蓋置於搖床（150rmin-1），溶解24h。
（4）六偏磷酸鈉溶液（5%，pH2.0）：50.0g分析純六偏磷酸鈉溶於800ml雙蒸水，用分析純濃磷酸調節至pH2.0，再用雙蒸水定容至1L。注意：六偏磷酸鈉溶解速度很慢應提前配製，且由於其易粘於燒杯底部，加熱時常因受熱不均使燒杯破裂。
（5）過硫酸鉀溶液（2%）：20.0g分析純過硫酸鉀溶於雙蒸水，定容至1L。注意：過硫酸鉀溶液易被氧化，應避光存放，使用期最多為7d。
（6）磷酸溶液（21%）：37ml85%分析純濃磷酸與188ml雙蒸水混合。
（7）鄰苯二甲酸氫鉀標準溶液[ρ（C6H4CO2HCO2K）=1000mgCL-1]：2.1254g分析純鄰苯二甲酸氫鉀（稱量前先經105℃烘2～3h），溶於雙蒸水，定容至1L。
2、儀器裝置
碳?自動分析儀（Phoenix8000）、真空乾燥器（直徑22cm）、水泵抽真空裝置（圖6?1）或無油真空泵、pH?自動滴定儀、塑料桶（帶螺旋蓋可密封，體積50L）、可密封螺紋廣口塑料瓶（容積1.1L）、高溫真空絕緣酯（MIST?3）、燒杯（25、50、80ml）。
3、操作步驟
（1）土壤前處理
新鮮土壤應立即處理或保存於4℃冰箱中，測定前先仔細除去土壤中可見植物殘體（如根、莖和葉）及土壤動物（如蚯蚓等），過篩（孔徑<2mm）並混勻。如果土壤過溼，應在室內適當風乾，並經常翻動，以避免區域性乾燥，至土壤含水量約為田間持水量（Water-holdingcapacity，WHC）的40%（以手感溼潤疏鬆但不結塊為宜）。如果土壤過於乾燥，用蒸餾水調節含水量至田間持水量的40%。將土壤置於密封的塑料桶內，在25℃下預培養7～15d，桶內有適量水以保持相對溼度為100%，並在桶內放一小杯1molL-1NaOH溶液以吸收土壤呼吸產生的CO2。這些過程是為了消除土壤水分限制對微生物的影響，以及植物殘體對測定的干擾。經預培養的土壤應立即分析，否則，應置於4℃下儲存，但分析前需在上述條件下至少再培養24h。
（2）燻蒸
稱取經前處理相當於50.0g烘乾基的新鮮土壤3份，置於80ml燒杯中。將燒杯放入真空乾燥器中，同時放入盛有去乙醇氯仿（約2/3燒杯）的燒杯2～3個，燒杯內放入少量經濃鹽酸溶液浸泡過夜後洗滌烘乾的瓷片（0.5mm大小，防瀑沸），或放入抗瀑沸的顆粒，同時放入一小燒杯稀NaOH溶液以吸收燻蒸期間釋放出來的CO2，乾燥器底部還應加入少量水以保持溼度。用燻蒸抽真空裝置（也可採用無油真空泵，如DOA-P181-BN型真空/正壓泵）抽真空，在?0.07MPa真空度下使氯仿劇烈沸騰3～5min。關閉真空乾燥器閥門，於25℃黑暗條件下燻蒸24h。開啟乾燥器閥門時，由於空氣進入應該有明顯的聲音；否則，意味著抽真空不夠或漏氣，應重新進行燻蒸。
取出土壤和氯仿（氯仿到回貯存瓶，可再使用），將裝土壤的燒杯轉入清潔真空乾燥器，同上反覆抽真空（?0.07MPa）直到土壤無氯仿味為止；否則，殘留在土壤中的氯仿將影響分析結果。一般需要反覆抽真空5～6次，每次3min，每次抽真空後，最好完全開啟乾燥器，以加快去氯仿速度和效果。燻蒸的同時，另稱取等量的土壤3份，置於另一干燥器中，除不加入去乙醇氯仿進行燻蒸外，其他操作與燻蒸土壤一樣，作為“對照”土壤。
（3）浸提
將燻蒸土壤無損地轉移到200ml聚乙烯塑料瓶中，加入100ml0.5molL-1K2SO4，土水比為1:4（w:v），振盪（25℃，300rmin-1）浸提30min，用中速定量濾紙過濾於125ml塑料瓶中。燻蒸開始的同時，另稱取等量的3份不燻蒸土壤於200ml聚乙烯浸提塑料瓶中，加入100ml0.5molL-1K2SO4同上浸提。同時做3個不加土壤的試劑空白。浸提液應立即分析，或在?18℃下儲存。
（4）測定
取10ml土壤浸提液於40ml樣品瓶中（注意解凍的浸提液在取樣前應徹底混勻），加入10ml六偏磷酸鈉溶液（pH2.0），使浸提液中的沉澱（CaSO4和K2SO4）全部溶解。採用碳?自動分析儀（Phoenix8000）測定樣液有機碳含量。基本過程：先在樣液中通入高純度氮氣5～10min，以除去溶解在浸提液中的部分CO2，樣液再進入無機碳排除管進一步去掉殘留的CO2，然後樣液進入紫外氧化管，在紫外燈以及過硫酸鉀溶液和磷酸溶液的作用下，浸提液中的有機碳全部氧化為CO2並釋放出來，產生的CO2經一系列純化後通過紅外檢測器測定。載氣為高純度氮氣。詳細操作步驟參見儀器使用說明。
工作曲線：分別吸取0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml濃度為1000mgCL-1鄰苯二甲酸氫鉀標準溶液於100ml容量瓶中，用雙蒸水定容。即得0、20、40、60、80、100mgCL-1系列標準碳溶液。分別吸取上述不同濃度的標準碳溶液10ml於40ml樣品瓶中，按上述相同方法測定。
（5）結果計算
土壤微生物生物量碳：BC=EC/kEC
式中：EC=燻蒸土壤浸提的有機碳?不燻蒸土壤浸提的有機碳；
kEC為轉換系數，取值0.45（Wu等，1990）。
二、土壤微生物生物量氮（氯仿燻蒸－K2SO4提取－碳自動分析法）
1、試劑配製
（1）去乙醇氯仿：同上
（2）硫酸鉀浸提液：同上
（3）硫酸鉻鉀還原劑：硫酸鉻鉀還原劑（5%）：50.0g分析純硫酸鉻鉀，溶於200ml分析純濃硫酸（H2SO4，ρ=1.84gml-1），用蒸餾水稀釋到1L。
（4）硫酸銅溶液[c（CuSO4）=0.19molL-1]：30.324g分析純硫酸銅（CuSO4）溶於蒸餾水，定容至1L。
（5）氫氧化鈉溶液[c（NaOH）=10molL-1]：400g分析純氫氧化鈉溶於蒸餾水，定容至1L。
（6）氫氧化鈉溶液[c（NaOH）=4molL-1]：160g分析純氫氧化鈉溶於雙蒸水，定容至1L，過濾（<0.45μm）。
（7）氫氧化鈉溶液[c（NaOH）=0.01molL-1]：2.5ml4molL-1NaOH溶液用色譜純水稀釋至1L。
（8）硼酸溶液（2%）：20.0g分析純硼酸（H3BO4）溶於蒸餾水，定容至1L。
（9）硫酸溶液[c（H2SO4）=0.05molL-1]：28.8ml分析純濃硫酸（H2SO4，ρ=1.84gml-1）用蒸餾水稀釋定容至1L，此溶液硫酸濃度為0.5molL-1，將該溶液稀釋10倍即可得到0.05molL-1硫酸溶液，再用0.1molL-1標準硼砂溶液標定其準確濃度。
（10）指示劑貯存液：1.0g氨混合指示劑溶於10ml0.01molL-1NaOH和10ml95%乙醇混合液，用雙蒸水定容至200ml。此貯存液可儲存1個月。
（11）指示劑溶液：10ml指示劑貯存液用雙蒸水稀釋定容至500ml，過濾（<0.45μm）。此溶液應使用前一天配製，最多可使用1周。
（12）氯化銨標準貯存液[ρ（NH4Cl）=1000μgNml-1]：3.8190g分析純氯化銨（稱量前經105℃烘2～3h）溶於雙蒸水，並定容至1L。此貯存液可穩定儲存數月。
（13）氯化銨標準溶液[ρ（NH4Cl）=50μgNml-1]：10ml1000μgNml-1氯化銨貯存液用雙蒸水稀釋至200ml。此溶液最多儲存7d。
2、儀器裝置
流動注射氮分析儀（FIAStar5000，FOSS公司）或定氮儀、pH自動滴定儀、真空抽濾瓶，微孔濾膜（<0.45μm）、容量瓶（100ml）、其他儀器裝置同上。
3、操作步驟
（1）土壤前處理、燻蒸、浸提同上。
（2）消化：取10.0ml浸提液（或經還原反應後的浸提液）於250ml消化管中，加入0.2ml0.19molL-1CuSO4溶液、5ml分析純濃硫酸、及少量防瀑沸的顆粒物，混合液消化變清後再回流3h。
（3）消化液中氮的測定：消化液冷卻後，用雙蒸水洗滌轉移到100ml容量瓶中，至體積大約為70ml，待冷卻後緩慢加入10ml10molL-1NaOH溶液中和部分H2SO4，邊加邊充分混勻，以免因區域性鹼濃度過高而引起消化液中NH3的損失，再用雙蒸水定容至100ml。溶液中NH4+含量採用流動注射氮分析儀（FIAStar5000型）測定。採用40μl樣品圈，KTN擴散膜（耐強酸和強鹼），載液為雙蒸水，試劑Ⅰ為4molL-1NaOH溶液，試劑Ⅱ為指示劑溶液。校正曲線溶液製備：分別取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml50μgNml-1氯化銨標準溶液於100ml容量瓶中，再分別用雙蒸水洗滌轉移1個空白消化液於容量瓶中，其餘操作步驟同樣液。然後用雙蒸水定容至100ml，即得濃度分別為0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5μgNml-1系列氯化銨標準溶液，採用測定KTN方法模組測定和製備校正曲線。校正曲線溶液最少應每個月製備一次。其他具體操作參見儀器使用說明。
（6）計算
土壤微生物生物量氮：BN=EN/kEN
式中：EN=燻蒸土壤浸提測定的全氮?不燻蒸土壤浸提測定的全氮；kEC為轉換系數，取值0.45。
