分子實驗[優秀範文]

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一、實驗目的

1、學習與掌握利用ITS序列鑑定真菌的原理；

2、掌握用ITS序列鑑定真菌的方法有步驟。

二、實驗原理

1、菌物是真核生物的重要類別，傳統的菌物分類以子實體形態特徵和生理生化指標為分類基礎，由於部分菌物的子實體不易獲得，形態特徵不易掌握，少數形態特徵和生理生化指標隨著環境的變化而不穩定，是傳統的菌物鑑定工作困難或分類系統意見分歧。內轉錄間隔區ITS(internal transcribed space),位於5.8S和18S之間（ITS1）以及5.8S和28SrDNA之間(ITS2)，ITS1和ITS2常被合稱為ITS，並且5.8SRNA基因也被包括在ITS之內。近年來，利用真核生物在rDNA的ITS區域既具保守性又在科、屬、種水平上均有特異性序列的特性，對ITS區進行PCR擴增、測序。隨著核糖體rDNA ITS序列分析技術在菌物研究中的應用，一些分類地位不明確、親緣關係不清楚的物種通過該技術得到了解決，一些重要的菌物遺傳資訊得到闡明。

2、ITS（Internal Transcribed Spacer）：內轉錄間隔區。是真菌核糖體RNA（rRNA）基因非轉錄區的一部分。用於真菌鑑定的ITS序列通常包括ITS1、5.8 S和ITS2。真菌ITS區域長度一般在650～750 bp(鹼基對)。

ITS（Internal Transcribed Spacer）鑑定是指對ITS序列進行DNA測序，通過將測序得到的ITS序列與已知真菌ITS序列比較，從而獲得未知真菌種屬資訊的一種方法。

ITS鑑定的原理：rDNA上的5.8、18和28 SrRNA基因有極大的保守性,即存在著廣泛的異種同源性。而由於ITS區不加入成熟核糖體,所以ITS片段在進化過程中承受的自然選擇壓力非常小,因此能容忍更多的變異。在絕大多數的真核生物中表現出了極為廣泛的序列多型性,即使是親緣關係非常接近的2個種都能在ITS序列上表現出差異,顯示最近的進化特徵。研究表明,ITS片段的進化速率是18 S rDNA的10倍。這就是ITS序列在微生物種類鑑定和群落分析的理論基礎。ITS1和ITS2是中度保守區域,其保守性基本上表現為種內相對一致,種間差異比較明顯。這種特點使ITS適合於真菌物種的分子鑑定以及屬內物種間或種內差異較明顯的菌群間的系統發育關係分析。由於ITS的序列分析能實質性地反映出屬間、種間以及菌株間的鹼基對差異,此外ITS序列片段較小、易於分析,目前已被廣泛應用於真菌屬內不同種間或近似屬間的系統發育研究中。ITS的序列分析還有效地解決Lenti nul a、Suill us、Tuber、Cer at ocystis和Oi diodendron等真菌應用形態學特徵進行分類所引起的紛爭,彌補了傳統分類上的一些不足。

ITS 鑑定的方法學：真菌rDNA ITS序列分析用於真菌系統分類通常通過多聚酶鏈式反應(PCR)技術實現。rDNA多複製的特性,有利於低濃度或被更高度降解的DNA樣品中ITS區域的擴增。這有利於研究尚無任何rDNA序列資料的生物。根據這些基因上高度保守區段設計出通用引物,藉助PCR技術擴增rDNA的目的片段。PCR技術在真菌分類、鑑定中與直接測序法相結合有很大的優越性[ 14] : ①只需少量的DNA,每次擴增只需約0.1～10 ng;②可對DNA的2條鏈測序,從而減少錯誤;③可利用總DNA的較粗製備品;④適合於自動測序儀進行測序。

三、實驗器材

1、真菌總基因組DNA的提取及其純度、濃度的檢測：

1)、儀器：離心機離心管移液槍(200μL、1000μL)槍頭研缽恆溫水浴鍋超淨工作臺瓊脂糖凝膠電泳系統一次性手套凝膠成像系統

紫外分光光度計

2)、材料：真菌3)、試劑：

(1)、DNA提取液：0.2M Tris-HCl（pH 7.5），0.5M NaCl，0.01M EDTA，1％SDS

(2)、3M NaAc

(3)、TE：10 mmol/L Tris-HCl pH8.0，1 mmol/L EDTA

(4)、酚（pH8.0）:氯仿:異戊醇(25:24:1)

(5)、氯仿:異戊醇(24:1)(6)、異丙醇

(7)、無水乙醇

(8)、75%乙醇

(9)、加入巰基乙醇(10)、RNaseA

2、ITS片段的PCR擴增及其產物電泳檢測：

1)、儀器：PCR熱迴圈儀瓊脂糖凝膠電泳系統移液槍一次性手套2)、材料：真菌ITS片段3)、試劑：

（1）、引物：ITS4：5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’(5’端引物)ITS5: 5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’(3’端引物)

（2）、ddH2O(2.5mM)

（3）、10×MgCl2緩衝液

（4）、DNA模板

（5）、脫氧核糖核酸聚合酶(Taq酶)

（6）、50×TAE貯存液

（7）、6×加樣緩衝液

（8）、100bpDNA ladder。

(9)、溴酚藍染料

3、ITS片段測序

1)、儀器：PCR熱迴圈儀高壓電泳儀測序用電泳槽制膠裝置吸頭、與電泳玻璃相配的染色盤、小指管

2)、材料：ITS片段PCR擴增產物3)、試劑：

藥品：三羥甲基氨基甲烷（Tris）乙二胺四乙酸(EDTA)硼酸尿素丙烯醯胺N，N’-亞甲基雙丙烯醯胺（Bis）過硫酸銨冰乙酸碳酸鈉（Na2CO3）甲醛硫代硫酸鈉硝酸銀（AgNO3）測序級Taq DNA聚合酶4種d/ddNTP混合液pGEM-3ZF(+)對照DNA 1μg/μL ITS4/ITS5正向引物粘合矽烷矽烷

溶液：

（1）、5×TBE：

Tris 13.5g硼酸6.9g EDTA 0.9g用雙蒸水定容至250mL

（2）、6%變性聚丙烯醯胺凝膠貯液：

尿素

63.06g

丙烯醯胺8.5g

N，N’-亞甲基雙丙烯醯胺0.45g 5×TBE 15mL用雙蒸水定容至150mL（用普通濾紙過濾後使用）。

4、BLAST比對、鑑定屬、種：

儀器：電腦及攜帶BLAST程式（基本區域性相似性比對搜尋工具）

5、進化樹的繪製

儀器：電腦及攜帶MEGA軟體（分子進化遺傳分析）

四、實驗內容及步驟

(一)、實驗內容：

1、大量真菌的準備;

2、真菌總基因組DNA的提取；

3、真菌基因組DNA純度、濃度的檢測；

4、ITS片段的PCR擴增；

5、ITS片段的PCR擴增產物電泳檢測；

6、ITS片段測序；

7、BLAST比對、鑑定屬、種。

(二)、實驗步驟：

1、真菌總基因組DNA的提取及其純度、濃度的檢測：

（1）、準備大量的真菌，然後去1g真菌，在液氮中迅速研磨成粉。

（2）、2%CTAB抽提緩衝液在65℃水浴中預熱；

(3)、在1.5mL離心管中加入65℃預熱的抽提液700μL。

(4)、加入巰基乙醇50μL，上下震盪，使蛋白質變性沉澱，65℃水浴40min，每隔10min振盪混勻一次。

(5)、加入等體積（約750μL）的氯仿/異戊醇(24/1)混勻，除去蛋白質，4℃平衡離心，10000rpm，10min。(6)、取上清（約750μL）到1.5mL離心管中，加1/5體積（約150μL）65℃預熱的CTAB/NaCl混勻，加入600μL的氯仿/異戊醇(24/1)混勻，4℃平衡離心，10000rpm，10min。

(7)、取上清，加等體積（約750μL）的CTAB沉澱液，顛倒混勻。65℃水浴30min至沉澱可見。4℃平衡離心，10000 rpm，10min後小心去上清。

(8)、沉澱用TE（0.5mL）溶解，加入等體積（約0.5mL）的酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)抽提，4℃平衡離心，10000rpm，10min。

(9)、取上清加入2倍體積的無水乙醇（1mL），再加入1/10體積的NaAC（pH 5.2）約0.1mL。

(10)、-20℃冰箱1h，4℃平衡離心，12000rpm，10min，棄上清，用70%酒精清洗2次，濾紙吸去多餘水分，超淨臺吹乾。

(11)、0.05mL TE溶解，加入5μLRNA酶液37℃放置30min；(12)、吸取適量樣品於紫外分光光度計上檢測濃度與純度；

(13)、剩餘的樣品置於-20℃儲存待用。

2、ITS片段的PCR擴增及其產物電泳檢測

ITS4：5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’ ITS5: 5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’

1)、PCR Amplification reaction system（PCR擴增反應體系）（50μl）ddH2O 38.5μl 10×buffer with MgCl2(MgCl2緩衝液)5.0μl dNTPs(2.5mM)1.0μl Primer5’（5’端引物）2.0μl Primer3’（3’端引物）2.0μl DNA template（DNA模板）1.0μl Taq DNA polymerase(脫氧核糖核酸聚合酶)(5U/μl)0.5μl

2)、反應程式如下：

（1）94℃ for 5 minutes denaturalization（94℃預變性5min）

（2）94℃ for 45 seconds denaturation（94℃變性45s）

（3）52℃ for 45 seconds annealing(52℃退火45s)

（4）72℃ for 1min30sec extension（72℃延伸90s）重複步驟(2)-(4)30次

（5）72℃ for 10 minutes final extension（72℃最後一次延伸10min）大概500bp左右

3)、取5μl進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，其餘-20℃儲存：

(1)、瓊脂糖凝膠：將50×TAE貯存液用蒸餾水稀釋成1×TEA電泳緩衝液，待用，按1%稱取適量瓊脂糖置於250mL錐形瓶中，加入對應量1×TEA稀釋緩衝液，蓋上封口膜，以減少水分蒸發，放入微波爐里加熱沸騰，取出搖勻，使瓶壁上粘附的瓊脂糖全部溶解，反覆3次，至瓊脂糖全部溶化，放置，待其稍冷卻。

(2)、膠板的製備：將制膠槽置於水平支援物上，選擇合適厚度和齒數的樣品梳，插上梳子。向冷卻至50-60℃的瓊脂糖凝膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液數滴，搖勻，小心地倒入制膠槽內，使膠液形成均勻的膠層。待膠完全凝固後，小心拔出梳子，將膠塊取出，至於已加入足量1×TEA電泳緩衝液的電泳槽內。

(4)、加樣：取5μl樣品與2μl 6×加樣緩衝液混勻，用微量移液槍小心加樣品槽中，在第一個孔或最後一個上樣孔內加入5μl的100bpDNA ladder。

(5)、電泳：接通電泳槽與電泳儀的電源，以5V/cm(約100V)電泳，當溴酚藍染料移動到距凝膠前沿1-2cm處，停止電泳。

(6)、成像：戴上一次性手套，在波長為254nm的紫外燈下觀察膠塊，DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶，用凝膠成像系統照相。

3、ITS片段測序

（一）測序反應：

1.對於每組測序反應，標記四個0.5ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml適當的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(約20ml)石蠟油，蓋上蓋子保存於冰上或4℃備用。

2.對於每組四個測序反應,在一個eppendorf管中混合以下試劑：

（1）樣品反應：

質粒模板DNA 2.1pmol 5×測序緩衝液5ml引物4.5pmol無菌ddH2O至終體積16ml

（2）對照反應

pGEM-3Zf(+)對照DNA(4mg)4.0ml

5×測序緩衝液5ml

ITS4/ITS5正向引物(4.5pmol)3.6ml

無菌ddH2 O至終體積16 ml

3.在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0ml測序級Taq DNA聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸動幾次混勻。

4.從第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一個d/ddNTP混合物的管內。

5.在微量離心機中離心一下，使所有的溶液位於eppendorf管底部。

6.把G、A、T、C 4個反應管放入預熱至95℃的熱迴圈儀，先經過95℃ 2min，然後進入如下迴圈：

95℃ 30s變性42℃ 30s退火70℃ 1min延伸45-60個迴圈後，取出置於冰箱中

7.熱迴圈程式完成後，在每個小管內加入3μl DNA測序終止溶液，在微量離心機中略一旋轉，終止反應。

（二）、測序凝膠板的製備

1、玻璃板的處理：

（1）短玻璃板的處理

A.在1ml 95%乙醇, 0.5%冰乙酸中加入5ml粘合矽烷(Bind Silane),配成新鮮的粘合溶液。

B.用經浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉紙擦拭仔細清洗過並已經自然乾燥的玻璃板,整個板面都必須擦拭。

C.4-5分鐘後,用95%乙醇單向擦玻璃板,然後略用力沿垂直方向擦拭。重複三次這一清洗過程,每次均須換用乾淨的紙,除去多餘的粘合溶液。

2、長版處理（換雙橡膠手套）

(1)、用浸透矽烷的吸水紙仔細擦邊玻璃板表面。

(2)、5-10min後，用浸透95%乙醇的乾淨吸水紙輕輕擦去多餘矽烷(矽烷不能過量，否則影響印染效果)。(3)、用0.4mm邊條裝配好，再用膠帶粘好，用夾子夾好以防滲漏。

(4)、將板呈40°角傾斜，按下面的比例直接混合溶液，然後用燒杯直接灌膠，或用50mL注射器注入，避免出現氣泡（氣泡出現，可敲擊玻璃板，使之排出）。

6%變性聚丙烯醯胺凝膠貯液90mL，四甲基乙二胺(TEMED)60μL，過硫酸胺90μL。灌滿後將鯊魚梳子背面插入液麵5-6mm，將板放置20°角使之聚合。在室溫中約20min內聚合（注意底部不要邊條，直接用膠帶封，否則邊條不易取出）。

3、測區產物凝膠電泳（凝膠灌製後2-24h後均可獲得良好結果）

(1)、去掉凝膠兩邊和底部膠帶紙，拔下鯊魚齒梳並轉過來用尖齒插入凝膠約1mm。將凝膠板安裝到電泳儀上，在電極上、下槽都倒入1×TBE電泳緩衝液，用吸管吹洗掉梳齒形成加樣孔中殘留的尿素，並去掉氣泡。

接穩定電源，40cm膠以1300V預電泳20-30min，是凝膠加熱到60℃左右。

(2)、將G、A、T、C 4個小管，各加入3μLDNA測序反應終止液，置於沸水中煮沸2min迅速插入冰中，上樣前，短暫離心混勻。

(3)、關閉電源，上樣4μL。

(4)、上樣後，繼續電泳，直至二甲苯藍染料距離玻璃板底部2cm時，終止電泳。

4、DNA測序凝膠的銀染法處理

(1)、玻璃板的分離：電泳結束後，小心揭開玻璃板，凝膠應牢牢黏附在短板上。

(2)、凝膠的固定：將凝膠連同放入磁碟中，加入固定液，注意要沒過凝膠，放置20min直至溴酚藍和二甲苯藍的顏色消失。緩緩水平搖動。固定液可回收做定影液。

(3)、洗膠：用雙蒸水漂洗凝膠3次，每次2min。漂洗時輕輕搖動，每次前都將膠瀝乾10-20s。

(4)、凝膠的染色：加入染色液緩緩搖動染色30min（25min後可在另一瓷盤中備好顯影液，同時要預冷到10℃）。

(5)、凝膠的漂洗：由於這一步非常關鍵，所以操作一定要非常快。將染色液倒入一個容器內，將瓷盤用雙蒸水涮一下，然後倒入3L雙蒸水，將凝膠浸入，然後將凝膠立即放入準備好的預冷顯影液中（從膠浸入雙蒸水到放入顯影液不能超過5-10s，如超過則重複（4）（5）步）。

(6)、凝膠的顯影：緩緩搖動，直到凝膠上顯條帶，一般為5-6min，時間不要過長，否則背景會過深（邊搖動，邊觀察，棕褐色條帶到一定強度後，馬上終止）。

(7)、終止顯影：將等體積定影液直接加入顯影液，緩緩搖動2-3min（時間過長會使染色變淡）。

(8)、凝膠的漂洗：用雙蒸水漂洗2次，每次2min。

(9)、將凝膠放在空氣中乾燥，識讀序列。

4、BLAST比對、鑑定屬、種

5、進化樹的繪製